The cardioprotective enzyme paraoxonase‐1 (PON1) suffers an important influence from genetic polymorphisms and nutritional factors. The aim of this study was to investigate the influence of diet, nutritional status, and the C(‐107)T polymorphism on PON1 arylesterase activity in children.
MethodsThis was a cross‐sectional study with 97 children, aged between 5 and 8 years, of both genders, from a pediatric outpatient clinic in southern Brazil. A sociodemographic, behavioral, and food consumption questionnaire was applied, and anthropometric measurements and laboratory blood samples were taken. PON1 arylesterase activity was measured by phenol extinction (U/mL), and DNA extraction and analysis of the PON1 C(‐107)T polymorphism were performed. The Hardy–Weinberg equilibrium was tested with the chi‐squared test and linear regression was used to estimate PON1 activity according to four adjustment models, with an acceptable error of 5%.
ResultsIn the sample, the male gender accounted for 50.5%, 39.2% were 6 years of age, 54.5% had normal weight, and 51.5% had PON1 activity below the median (90.0, 15–30U/mL). Genotype frequency was 54.6% (53/97), 31.0% (30/97), and 14.4% (14/97), respectively, for CT, CC, and TT, consistent with the Hardy–Weinberg equilibrium (p=0.22). In the regression analysis, the model that included sociodemographic variables as well as frequency of consumption of fruits, vegetables, legumes, dairy products, and beans estimated a variability of 14.8% in PON1 activity combined with the PON1 C(‐107)T polymorphism.
ConclusionsDuring childhood, a good‐quality diet with greater inclusion of healthy foods was important to predict the activity of the cardioprotective enzyme PON1 combined with the C(‐107)T polymorphism of the PON1 gene.
A enzima cardioprotetora Paraoxonase 1 (PON1) sofre importante influência de polimorfismos genéticos e fatores nutricionais. O objetivo deste estudo foi investigar a influência da alimentação, do estado nutricional e do polimorfismo C(‐107)T sobre a atividade arilesterase da PON1 em crianças.
MétodosEstudo transversal com 97 crianças entre 5 e 8 anos, de ambos os sexos, de um ambulatório de pediatria no sul do Brasil. Realizou-se questionário sociodemográfico, de comportamento e de consumo alimentar, medidas antropométricas e coleta de sangue em laboratório. A atividade arilesterase da PON1 foi mensurada pela extinção de fenol (U/mL), realizada extração do DNA e análise do polimorfismo PON1 C(‐107)T. O equilíbrio de Hardy‐Weinberg foi testado com qui‐quadrado e usada regressão linear para estimar a atividade da PON1 segundo quatro modelos de ajuste, erro aceitável de 5%.
ResultadosNa amostra o sexo masculino representou 50,5%, 39,2% tinham 6 anos, 54,5% eram eutróficos e 51,5% tinha atividade da PON1 inferior à mediana (90,0;15‐30U/ml). A frequência dos genótipos foi 54,6% (53/97), 31,0% (30/97) e 14,4% (14/97), respectivamente, para CT, CC e TT, estiveram em equilíbrio de Hardy‐Weinberg (p=0,22). Na análise de regressão o modelo que incluiu variáveis sociodemográficas, de frequência do consumo de frutas, verduras, legumes, laticínios e feijões estimou uma variabilidade de 14,8% na atividade da PON1 combinada ao polimorfismo PON1 C(‐107)T.
ConclusõesNa infância uma alimentação de boa qualidade, com maior participação de alimentos saudáveis foi importante para predizer a atividade da enzima cardioprotetora PON1 combinada ao polimorfismo C(‐107)T do gene da PON1.
A PON1 é uma enzima de 43kDa expressa em humanos, sobretudo no fígado, detectada no plasma ligada às Apo‐proteínas A1 e J das partículas da lipoproteína de alta densidade (HDL).1 A enzima impede o dano oxidativo aos fosfolipídios das lipoproteínas, em especial na lipoproteína de baixa densidade (LDL).1,2 Dessa maneira a PON1 previne o efeito pró‐inflamatório dos lipoperóxidos na camada íntima dos vasos sanguíneos e sua maior atividade repercute em redução do risco de doença cardiovascular (DCV).2,3 Essa enzima hidrolisa um amplo espectro de substratos, mas sua atividade arilesterase (fenilacetato) é especialmente importante para redução do dano endotelial e DCV.1–3 A PON1 sofre importante influência de polimorfismos genéticos e fatores nutricionais.1,3,4
O gene da PON1 se localiza no cromossomo humano 7, exibe 9 éxons e codifica uma proteína com 354 aminoácidos.1,5 Mais de 200 polimorfismos foram descritos nesse gene.1,3 No entanto, o polimorfismo caracterizado na região promotora PON1C(‐107)T exerce efeito significativo na enzima, é um forte preditor de sua atividade arilesterase.5,6 O alelo –107C proporciona níveis de PON1 até duas vezes mais elevados do que aqueles observados com o alelo –107T.5,6 Há evidências de que esse polimorfismo no promotor do gene PON1 se localiza no ponto de ligação do fator de transcrição Sp1.5,6 Portanto, a presença do alelo C resulta em maior expressão do gene PON1 e maior atividade sérica da enzima.5,6
Dentre os fatores nutricionais, os ácidos graxos monoinsaturados e as vitaminas antioxidantes, a exemplo das vitaminas C e E, aparecem como responsáveis pelo aumento da atividade da PON1.7–10 Da mesma forma um maior consumo de frutas, verduras e legumes se associou a uma atividade mais elevada da enzima.9,10 Por outro lado, estudos indicam que o excesso de peso repercute em menor atividade da PON1, inclusive na infância.11–13 A infância é um período vulnerável da vida, contudo na atualidade as crianças estão expostas a múltiplos fatores de risco cardiovasculares e metabólicos.14 Sabe‐se que a alimentação das crianças brasileiras é pobre em frutas, legumes e verduras e rica em bebidas açucaradas, biscoitos recheados, hambúrgueres, salgados e embutidos.15 Além disso, o expressivo aumento da prevalência do excesso de peso a partir dos 5 anos correlaciona‐se diretamente ao incremento de morbidades associadas na população infantil.15,16 Essa alimentação de má qualidade e o excesso de peso predispõem ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio, ao dano oxidativo as membranas biológicas e ao início de doenças, em particular DCV.11,12,16
Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi investigar a influência da alimentação, do estado nutricional e do polimorfismo genético C(‐107)T sobre a atividade arilesterase da enzima antiaterogênica PON1 na infância.
MétodosAmostraEstudo transversal feito com crianças entre 5 e 8 anos incompletos, de ambos os sexos, atendidas no Ambulatório de Pediatria da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Pelotas (UFPEL), na cidade de Pelotas – RS. O protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da UFPEL (504.362/2013).
Crianças diagnosticadas com doenças hepáticas, paralisia cerebral, displasia óssea ou neoplasias, aquelas portadoras de necessidades especiais (físicas ou motoras) e alterações genéticas, como síndrome de Down e talassemia, foram excluídas do estudo. Os responsáveis das crianças elegíveis foram devidamente esclarecidos e convidados, os que autorizaram a participação no estudo assinaram um Termo de Consentimento Livre Esclarecido – TCLE. O assentimento da criança foi questionado oralmente antes do início das avaliações e respeitada sua decisão.
Foram entrevistadas 227 crianças, dessas 193 atenderam aos critérios de inclusão, houve cinco recusas (2,6%). Noventa e uma crianças (49,7%) não completaram o protocolo do estudo, caracterizaram‐se como perdas. Destaca‐se como causa dessas perdas o não comparecimento ao laboratório para coleta de sangue (40,0%). No fim, o estudo contou com a participação de 97 crianças.
Dados sociodemográficos, antropometria e coleta de sangueOs responsáveis responderam a um questionário sociodemográfico, de comportamento e de consumo alimentar das crianças, foram feitas medidas antropométricas e foi a coleta de sangue em laboratório de análises clínicas.
As duas primeiras categorias de variáveis do questionário foram renda familiar (em R$ convertidos a salários mínimos vigentes), idade da mãe (anos completos), escolaridade materna (anos completos de estudo), número de pessoas no domicílio e tempo (em horas) frente a telas (computador, celular, tablet, videogames, televisão). A cor da pele foi observada e classificada como branca ou não branca.
O peso e altura foram coletados com balança plataforma digital (Welmy®), com capacidade de 150kg e precisão de 100g e estadiômetro acoplado com capacidade de 200cm e precisão de 0,5cm. Para avaliar o estado nutricional usou‐se o Índice de Massa Corporal (IMC) para idade em escore‐z, segundo recomendação da Organização Mundial da Saúde de 2007,17 por meio do programa AnthroPlus. Crianças com IMC‐para‐idade >+1DP foram classificadas com excesso de peso. A circunferência da cintura foi aferida na linha da cintura, no ponto médio entre a última costela e a crista ilíaca. O referencial de comparação foi o proposto por Freedman et al.18
Após jejum de 12 horas amostras de 5mL de sangue foram coletadas, aliquotadas e congeladas a ‐80oC para análises posteriores.
Determinação da atividade arilesterase da PON1A atividade arilesterase da PON1 foi medida em amostras de soro com o uso de fenilacetato como substrato. A atividade enzimática foi calculada a partir da velocidade de formação de fenol através do aumento da absorbância a 270nm, temperatura de 25°C, em espectrofotômetro (FEMTO®). As amostras foram diluídas 1:3 em 20mM de Tampão Tris/HCl (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA), pH 8,0, com 1mM de CaCl2 (Vetec Chemical Co, RJ, Br). A solução reagente foi composta pelo tampão, ao qual foi adicionado 1mM de fenilacetato (Sigma Chemical Co, St. Louis, USA). A reação foi determinada após 20 segundos de retenção e a absorbância medida por 80 segundos. Considerou‐se uma unidade de atividade arilesterase da PON1 igual a 1μM de fenol/minuto e essa foi expressa em U/mL, com base no coeficiente de extinção de fenol.16 As análises foram em duplicata e amostras em branco com água deionizada foram usadas para corrigir a hidrólise não enzimática.
Extração do DNA e análise do polimorfismo PON1 C(‐107)TO DNA foi extraído das amostras de sangue que continham EDTA de acordo com procedimento padrão descrito previamente por Kanai et al.19 e quantificado em espectrofotômetro. As amostras de DNA foram diluídas para concentração de 50 ng/mL. A genotipagem dos indivíduos para o polimorfismo PON1 C(‐107)T foi feita através da técnica de restriction fragment length polymorphism (RFLP) de acordo com o validado por Campo et al.20
Brevemente, um fragmento de 240pb da região do promotor do gene da PON1 foi amplificado por PCR em 35 ciclos (5