Infecções e reinfecções por Rotavirus A: genotipagem e implicações vacinais

Rotavirus A infections and reinfections: genotyping and vaccine implications
J Pediatr (Rio J). 2004;80(2):119-22

Introdução

Os rotavírus constituem-se na causa mais freqüente de diarréia aguda grave na infância em países desenvolvidos e em desenvolvimento (1). Cerca de 125 milhões de episódios diarréicos por rotavírus ocorrem globalmente a cada ano, culminando com 500.000 a 600.000 óbitos (2,3). Levantamentos epidemiológicos em escala mundial (4) observaram a incidência de 12 a 71% (média 34%) de identificação de rotavírus em crianças menores de 3 anos de idade com diarréia aguda. Dados revisados no Brasil demonstram variações na incidência de gastroenterites associadas a rotavírus em crianças atendidas em ambulatórios ou hospitais, da ordem de 12 a 42% (5-7).

Os Rotavirus A são classificados em genótipos G e P de acordo com variações antigênicas das proteínas estruturais VP7 e VP4, respectivamente. Há um predomínio, em escala global, das amostras caracterizadas como G1P[8] (8,9).

O impacto mundial da infecção pelo rotavírus tem conduzido ao desenvolvimento de estratégias vacinais capazes de reduzir a sua morbi-mortalidade. A vacina tetravalente (rotashieldTM) teve seu uso suspenso devido ao potencial (embora controverso) desencadeamento de invaginação intestinal (10-12). Novas candidatas à vacina têm sido avaliadas em estudos recentes (13-15).

O presente estudo avaliou a ocorrência de reinfecções por rotavírus e mapeou os genótipos prevalentes no intuito de subsidiar o desenvolvimento de procedimentos eficazes e seguros de prevenção, assim como de planejamento de ações de controle da doença diarréica por Rotavirus A.

Casuística e métodos

Foram estudadas 207 crianças com doença diarréica aguda, provenientes do atendimento nos prontos-socorros e enfermarias do Departamento de Pediatria e Puericultura da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Goiás e do Hospital Materno Infantil de Goiânia - Goiás, durante o período de julho de 2000 a outubro de 2002. Foi adotado como critério de inclusão a presença de doença diarréica aguda, considerada como a eliminação de três ou mais evacuações líquidas ou semilíquidas por dia. Os responsáveis pelos pacientes que preencheram o critério de inclusão foram esclarecidos sobre o estudo e, concordando com a participação da criança, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital das Clínicas da FMUSP.

Um total de 46 crianças com diarréia aguda e identificação de rotavírus nas fezes, e cujos responsáveis consentiram em permanecer em seguimento ambulatorial, foram selecionadas para um estudo prospectivo por um período de um ano. Igual número de crianças pareadas por idade e sexo, que não apresentavam diarréia aguda e sem identificação de rotavírus na amostras fecais à admissão ao estudo, representaram o grupo controle, seguindo os mesmos preceitos éticos.

Em ambos os grupos, avaliou-se a ocorrência de episódios diarréicos, associados ou não a reinfecções sintomáticas ou assintomáticas por rotavírus, durante o período de estudo, através da coleta das amostras fecais para a identificação dos rotavírus, no dia zero (admissão ao estudo), e a seguir mensalmente durante um ano de seguimento (além da coleta durante os episódios de diarréia aguda) das crianças dos grupos Rotavirus A positivo e controle. Os rotavírus foram identificados em amostras fecais através da eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) (16) e pelo ensaio imunoenzimático combinado para rotavírus e adenovírus (EIERA) (17).

A determinação de genótipos de Rotavirus A foi feita pela reação em cadeia pela polimerase e pela reação de Nested-PCR para detecção dos segmentos genômicos codificantes das proteínas VP4 (genótipos P) e VP7 (genótipos G). A realização da primeira reação de amplificação (RT-PCR) utilizou os primers consensuais 9con1/9con2 (genotipagem G) e 4con2/4con3 (genotipagem P). Na reação seqüencial de Nested-PCR, foi utilizada a mistura de iniciadores específicos para a identificação dos genótipos G1, G2, G3, G4, G5, G8, G9 e G10, bem como para a identificação dos genótipos P[4], P[6], P[8], P[9] e P[10]. Após a amplificação, os produtos obtidos de cada amostra fecal através do RT-PCR e da Nested-PCR foram aplicados em gel de agarose, visualizados em transluminador com luz ultravioleta e analisados em comparação com o padrão de peso molecular utilizado.

A análise estatística dos resultados foi realizada por meio do teste exato de Fisher, sendo fixado em 5% (alfa igual a 0,05) o nível de rejeição da hipótese de nulidade, com intervalo de confiança de 95%.

Resultados

Foram estudadas 207 crianças com doença diarréica aguda. Destas, 77 (37,2%) apresentaram positividade para Rotavirus A na primeira amostra fecal coletada, e 46 delas fizeram acompanhamento ambulatorial. Da mesma forma, 46 outras crianças que não apresentavam diarréia aguda à admissão nem detecção de rotavírus na primeira amostra fecal foram pareadas por idade e sexo e constituíram o grupo controle. Um total de 766 amostras fecais foram coletadas durante o seguimento em ambos os grupos; seis crianças de cada grupo foram excluídas do estudo por motivo de abandono.

A identificação dos genótipos G foi possível em 61 (79,2%) das 77 amostras de Rotavirus A. O genótipo G1 foi o mais prevalente, ocorrendo em 38 (62,3%) amostras genotipadas, seguido pelo genótipo G9, ocorrendo em 21 (34,4%) amostras, e G4, em duas amostras (3,4%).

Quanto aos genótipos P, sua identificação foi possível em 39 (50,6%) das 77 amostras de Rotavirus A. O genótipo P[8] foi o mais prevalente, sendo identificado em 23 (59%) das amostras genotipadas. O genótipo P[6] foi observado em três (7,7%) amostras. Um total de 16 amostras evidenciaram positividade simultânea para mais de um genótipo P, sendo identificadas as amostras com a dualidade P[6]+P[8] (23,1%), P[4]+P[8] (7,7%) e P[4]+P[6] (2,6%).

Em um total de 18 amostras (23,4%), foi possível correlacionar os genótipos G e P, sendo observado o predomínio (p < 0,05) das amostras caracterizadas como G1P[8] (77,8%), em comparação com G9P[8] (11,1%), G4P[8] (5,6%) e G1P[6] (5,6%) (Figura 1).

Figura 1 -
Distribuição das 18 amostras de Rotavirus A identificadas com genotipagem G e P durante todo o período de coleta

As 40 crianças do grupo seguimento Rotavirus A (+) apresentavam idade média de 19,2 meses, sendo 19 pacientes do sexo masculino e 21 do sexo feminino. Foram colhidas 380 amostras desse grupo durante o período de seguimento. Um total de 51 episódios diarréicos foi observado (média de 1,3 episódio diarréico/criança/ano). Em nenhuma amostra coletada das crianças desse grupo, no período de seguimento, foi identificado rotavírus.

O grupo controle, constituído também por 40 crianças, apresentavam idade média de 19,7 meses, sendo 20 crianças do sexo masculino e 20 do sexo feminino. Foram coletadas 386 amostras fecais no grupo controle. Observou-se um total de 48 episódios diarréicos nesse grupo, com média de 1,2 episódio diarréico/criança/ano. Em duas crianças deste grupo foram identificados rotavírus nas fezes, associados a quadro diarréico, resultando em uma incidência de 0,05 infecções por rotavírus/criança/ano.

Discussão

Foi observada uma positividade de 37,2% de Rotavirus A nas 207 amostras coletadas de crianças com diarréia aguda. De forma geral, dados semelhantes são observados na literatura (4-6).

Nas amostras genotipadas, observou-se o predomínio de G1, embora percentuais elevados de G9 tenham sido detectados, e somente duas amostras foram caracterizadas como G4. Vários autores têm relatado o predomínio das amostras caracterizadas como G1-G4 (5,8,9,18,19). Por outro lado, estudos demonstram a identificação crescente de sorotipos não usuais, com o genótipo G9 ocorrendo em 18,1% das infecções por rotavírus na Austrália (20). Tal fato ressalta que novos e emergentes sorotipos possam representar impacto nas estratégias vacinais, com ampliação na cobertura de genótipos além de G1-G4.

Em relação às associações G e P, houve predomínio das amostras caracterizadas como G1P[8]. O genótipo G1P[8], em âmbito global, destaca-se como o mais prevalente (8,9,21,22), o que pode subsidiar a implantação de candidatas a vacinas monovalentes humanas com especificidade para G1P[8] (rotarixTM - Glaxo Smithkline and Avant Imunotherapeutics, Inc, Needham, MA, USA), inclusive em nosso meio.

O estudo prospectivo das crianças Rotavirus A (+) e dos pacientes controle evidenciou a ausência de reinfecção por rotavírus, o que contrasta com vários estudos de seguimento, onde se obteve índices variáveis de reinfecção por rotavírus (7,23-28), os quais são mais elevados em estudos de acompanhamento desde o nascimento (13,23,24), bem como em estudo em comunidades restritas, como indígenas e crianças de creche (25,27,28). Por outro lado, estudo amplo realizado na Finlândia (29) não identificou, de forma similar à nossa observação, reinfecção por rotavírus. Talvez esse fato possa estar relacionado a uma possível proteção conferida por infecções naturais por rotavírus ocorridas previamente e ao seguimento restrito ao período de um ano.

Outro aspecto relevante foi a detecção de duas infecções sintomáticas por rotavírus observadas durante o seguimento dos pacientes do grupo controle. A incidência de infecções por rotavírus observada por alguns autores apresenta variações entre 0,07 a 0,8 episódios por crianças por ano (13,25,30,31), em seguimento de crianças a partir do nascimento até 2 a 3 anos de idade. Tais índices são superiores aos observados no presente estudo, da ordem de 0,05 episódios de infecções por rotavírus por criança por ano no grupo controle, o que pode ser justificado pela faixa etária mais elevada, uma vez que o grupo controle foi pareado de acordo com a idade de um grupo de crianças já infectadas por rotavírus. Baseado em estudo de prevalência sorológica (24,32) e da estimativa de que virtualmente todas as crianças até os 5 anos de idade já foram infectadas por rotavírus em pelo menos uma ocasião (33), é possível que uma porcentagem das crianças do grupo controle apresentasse algum grau de proteção frente a infecções prévias por rotavírus não detectadas neste estudo.

Este estudo pretende contribuir para o conhecimento da infecção pelos rotavírus do grupo A em crianças, através da vigilância dos genótipos G e P prevalentes na região. Dessa forma, pretende fornecer subsídios a pesquisas futuras de profilaxia em nosso meio, desde que outros estudos devam ser realizados, na vigilância contínua dos genótipos prevalentes em nosso meio, buscando a implementação definitiva de medidas preventivas eficazes no campo das infecções por rotavírus.

Agradecimentos

Ao apoio financeiro concedido exclusivamente através da Fundação de Apoio à Pesquisa (UFG) e CAPES.