Colostro humano: fonte natural de probióticos?

Human colostrum: a natural source of probiotics?
Franz R. Novak, João Aprígio Guerra de Almeida, Graciete O. Vieira, Luciana M. Borba
J Pediatr (Rio J) 2001;77(4):265-70

Introdução

Os primeiros estudos científicos sobre probióticos datam do começo deste século com o trabalho de Metchnikoff, no Instituto Pasteur. Esse investigador postulou que os leites fermentados produziam seus efeitos benéficos no hospedeiro, porque antagonizavam bactérias perniciosas no intestino(1-3). A hipótese inicial sobre os probióticos propunha que as cepas bacterianas que aderissem à superfície da mucosa intestinal de forma mais eficiente seriam mais benéficas para os seus portadores(2).

Dados científicos recentes têm ressaltado a contribuição da flora intestinal para a manutenção da saúde humana. Dentre os benefícios apontados, citam-se o antagonismo aos agentes patogênicos, o efeito de barreira da microbiota e a modulação das funções imunes(2,4-6).

Por vários anos, pesquisadores têm tentado fazer o isolamento, a identificação e a caracterização dos microorganismos existentes no intestino humano. Entretanto, a completa avaliação desta microbiota é um processo extremamente difícil(7).

Uma definição atual de probiótico é a seguinte: "um suplemento alimentar microbiano vivo, que afeta de forma benéfica seu receptor, através da melhoria do balanço microbiano intestinal"(1,2).

Por ocasião do nascimento, o intestino dos seres humanos é estéril. Entretanto, sua colonização bacteriana começará durante o parto e, em breve, outros microorganismos serão introduzidos juntamente com os primeiros alimentos(8). Em condições normais, a microbiota intestinal materna funcionará como a principal fonte de bactérias que colonizarão efetivamente o trato gastrintestinal do recém-nascido(9).

A alimentação exclusiva com leite materno é, reconhecidamente, a melhor forma de proteger o recém-nascido das enfermidades infecciosas; parte dessa proteção, provavelmente, se deve à influência que o leite materno tem sobre a composição da microbiota intestinal do recém-nascido(10,11). Nos países em desenvolvimento, onde é provável que os lactentes estejam expostos a numerosas bactérias desde o nascimento, a alimentação ao seio é considerada como sendo de máxima importância, pois o leite materno protege a criança de diversas infecções como diarréia, septicemia e infecções do trato respiratório, entre outras, reduzindo assim a mortalidade infantil(8).

Os lactentes alimentados com leite materno têm flora fecal diferente dos que são alimentados com fórmulas lácteas. Os primeiros têm predomínio de bifidobactérias e lactobacilos, e os alimentados com fórmulas apresentam mais coliformes e bacteróides(2).

A implantação intestinal das diferentes cepas bacterianas ocorre de tal forma que ela é regulada pelo meio intestinal, que se altera à medida que, sucessivamente, se estabelecem novos grupos bacterianos(8). Acredita-se que o tamanho da população será rigorosamente controlado pela competição pelos nutrientes e por espaço(8). Assim, os agentes patogênicos potenciais como a E. coli e outras enterobactérias serão mantidos em números reduzidos, sendo mais difícil que se estabeleçam novas bactérias recém-chegadas. Essa função da microbiota intestinal denomina-se "resistência à colonização"(12). Essa microbiota funciona como componente importante da barreira defensiva da mucosa intestinal(5).

A resposta à microbiota intestinal leva à formação de anticorpos séricos contra numerosas estruturas das bactérias presentes no intestino e se estende a outras mucosas e às glândulas exócrinas como as salivares e as mamárias, durante a lactação(2,5).

Depois de reagir com os componentes das bactérias em áreas especializadas denominadas placas de Peyer, os linfócitos migram para todas as partes da parede intestinal, disseminando a resposta imune a todo o intestino. Esses linfócitos serão transferidos por meio de mecanismos complexos ao leite materno, e, por meio deste, atuarão posteriormente sobre as bactérias intestinais do lactente, protegendo-o de infecções(13).

A resposta imune pode ajudar a controlar as bactérias intestinais, limitar sua translocação e diminuir os riscos de infecção. Com o tempo, a microbiota intestinal pode induzir à tolerância imunológica, tendo como resultado a diminuição da capacidade de reação a alguns de seus componentes. Caso apareça no intestino algum agente microbiano potencialmente patogênico, o organismo do hospedeiro produz uma nova resposta imune(14,15).

As bactérias reforçam constantemente as diferentes linhas de defesa do intestino através de mecanismos como a exclusão imunológica, eliminação de caráter imune e regulação imune, que permitem o estabelecimento desta convivência dinâmica entre os seres humanos e os microorganismos(16).

O colostro humano é definido como o primeiro produto da secreção láctea da nutriz, até o 7° dia pós-parto17. Deve-se considerar, para efeito de sua doação a um Banco de Leite Humano (BLH), que a magnitude dos contaminantes secundários, incorporados ao produto durante sua coleta, pode exercer efeito decisivo sobre a qualidade final do produto. Assim, a presença de contaminantes em níveis elevados acarreta a redução do seu valor biológico ou o desqualifica para o consumo(18).

A possibilidade da existência de um papel fisiológico para os microorganismos transferidos da mãe para o bebê durante a amamentação natural não está clara na literatura. Por isso, o presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de obter dados sobre a microbiota do colostro humano, visando correlacioná-la com a possibilidade de que seja uma fonte de probióticos, que seriam transmitidos da mãe para o filho durante a amamentação natural.

Métodos

Setenta amostras individuais de colostro foram obtidas no Alojamento Conjunto do Instituto Fernandes Figueira com emprego de técnicas assépticas, pelos técnicos do BLH, como forma de estimular a lactação ou promover coleta de alívio durante ingurgitamento mamário, no período de 11/08/99 a 11/06/00.
Do total, 24 (34,2%) das doadoras eram mães de bebês prematuros, com período de gestação variando entre 36 e 37 semanas incompletas. Destas, 3 estavam em uso de antibióticos no momento da coleta das amostras.

Imediatamente após a coleta, os frascos foram transportados sob resfriamento para o BLH do Instituto Fernandes Figueira, para serem coletadas amostras e encaminhadas ao Laboratório de Controle de Alimentos do referido Instituto, onde foram realizadas as análises da seguinte maneira:

Mesófilos

Procedeu-se de acordo com o método descrito no Compendium of Methods of the Microbiological Examination of Foods(19). Alíquotas de 1,0 ml do colostro e de suas diluições decimais selecionadas foram semeadas em duplicata, pela técnica de pour-plate em ágar-padrão-PCA (Merck). Após a solidificação do meio, as placas foram incubadas a 35°C por 48 horas. Foram contadas as colônias e os resultados expressos em unidades formadoras de colônias (UFC) por ml de colostro.

Termodúricos

Procedeu-se de acordo com o descrito para mesófilos, porém foram considerados como termodúricos os microorganismos resistentes a um aquecimento a 63°C por 30 minutos, em tubos de ensaio contendo 5 ml de colostro, antes da inoculação no meio de cultura(20); os resultados foram expressos em UFC/ml.

Psicrotróficos

Procedeu-se de acordo com o descrito para mesófilos, exceto no que se refere à temperatura e ao período de incubação que foram, respectivamente, de 7°C por 10 dias(20); os resultados foram expressos em UFC/ml.

Termodúricos-Psicrotróficos

Procedeu-se de acordo com o descrito para termodúricos, utilizando-se a temperatura e o período de incubação adotados para psicrotróficos(21); os resultados foram expressos em UFC/ml.

Proteolíticos

Procedeu-se de acordo com o descrito por Marth22. Alíquotas de 1,0 ml das diluições selecionadas foram semeadas em duplicata, pela técnica do pour plate em ágar-padrão-PCA (Merck), contendo 10% de leite desnatado. Após a solidificação do meio, as placas foram incubadas a 21±2°C por 72 horas. Após a incubação, verteram-se 3 ml de solução de ácido acético a 10% v/v sobre as placas, deixando-se por 1 minuto. Foram contadas as colônias características e os resultados expressos em UFC/ml.

Proteolíticos-Psicrotróficos

Procedeu-se de acordo com o descrito para proteolíticos, exceto no que se refere à temperatura e ao tempo de incubação, que foram de 7°C por 10 dias, respectivamente(21); os resultados foram expressos em UFC/ml.

Lipolíticos

Alíquotas de 1 ml das diluições decimais selecionadas foram semeadas em duplicatas, pela técnica de pour-plate em Ágar Tributirina e incubados a 25°C por 5 dias(22). Foram contadas as colônias características e os resultados expressos em UFC/ml.

Bolores e Leveduras

Procedeu-se de acordo com o método descrito por Marvin(19). Alíquotas de 1,0 ml de colostro e de suas diluições decimais selecionadas foram semeadas pela técnica de pour-plate, em Ágar Dextrose Batata - BDA (Merck). Após a solidificação do meio, as placas foram incubadas a 25°C por 5 dias. Foram contadas as colônias e os resultados expressos UFC/ml.

Staphylococcus aureus

Procedeu-se de acordo com o método descrito no Compendium of Methods for the Examination of Foods(19). Alíquotas de 0,1 ml de colostro e de suas diluições selecionadas foram semeadas em duplicata, pela técnica de inóculo em superfície com auxílio de uma alça de Drigalsky, em Ágar Baird-Parker (Merck). As placas foram incubadas a 35-37°C por 48 horas. Foram contadas as colônias típicas e os resultados expressos em UFC/ml.

Coliformes totais

Foram determinados pela técnica do Número Mais Provável, de acordo com o descrito no Standard Methods for the Examination of Dairy Products(22). Alíquotas das diluições decimais selecionadas foram inoculadas em série de três tubos, que continham Caldo Bile Verde Brilhante Lactose 2% - BGBL (Merck). Os tubos foram incubados a 37°C durante 24/48 horas. Após a incubação, observou-se a produção de gás. O número mais provável de coliformes foi calculado com o uso da tabela de McGrady(19). Os tubos positivos foram repicados com alça bacteriológica para novos tubos de BGBL e incubados a 37°C por 24/48horas para confirmação; os resultados foram expressos em número mais provável por mililitro (NMP/ml).

Coliformes fecais

Procedeu-se de acordo com o descrito no compêndio Microorganisms in Foods(23). Os tubos em que se confirmou a presença de coliformes totais foram repicados individualmente com alça bacteriológica para tubos contendo Caldo EC (Merck) e incubados a 44,5 * 0,1°C em banho-maria ultratermostático, por 24/48 horas. Após a incubação, observava-se a produção de gás; os resultados foram expressos em NMP/ml.

Streptococcus do grupo D

Procedeu-se de acordo com o descrito pelo Laboratório Nacional de Referência Animal(24). Alíquotas de 1,0 ml das diluições selecionadas foram inoculadas em triplicata, em tubos de ensaio contendo Caldo Azida Glicose (Merck) e incubados a 36°C por 48 horas, sendo o número mais provável calculado com o uso da tabela de McGrady.

Bactérias lácticas

Procedeu-se de acordo com o descrito por Lima(25), utilizando-se ágar-padrão-PCA acrescido de 0,004 g de púrpura de bromocresol e 0,5 g de lactose, por 100 ml de meio. Com o propósito de evitar a difusão do ácido produzido pelas colônias no ágar, foi adicionado 0,2% de carbonato de cálcio. Alíquotas de 1,0 ml do colostro e de suas diluições decimais selecionadas foram semeadas em duplicata, pela técnica de pour-plate. As placas foram incubadas a 32ºC por 48 horas; as colônias circundadas por um halo amarelo foram contadas, e os resultados expressos em UFC/ml.

Resultados

A distribuição percentual das amostras em função das contagens de mesófilos, 68,6%; termodúricos, 38,6%; psicrotróficos, 8,6%; termodúricos-psicrotróficos, 0,0%; proteolíticos, 15,7%; proteolíticos-psicrotróficos, 1,4%; lipolíticos, 4,3%; bolores e leveduras, 11,4%; Staphylococcus aureus, 44,3%; coliformes totais, 7,2%; coliformes fecais, 0,0%; Streptococcus do grupo D, 0,0%; e bactérias lácticas, 37,2%, pode ser observada de forma completa na Tabela 1.

Tabela 1 -
Distribuição percentual dos microorganismos/grupos nas 70 amostras de colostro analisadas

Discussão

A população de mesófilos foi inferior a 10e3 unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/ml) em 88,5 % das amostras analisadas. Esse índice é compatível com as faixas de ocorrência dos demais microorganismos estudados. O grupo de mesófilos inclui a maioria dos contaminantes presentes, permitindo uma visão da carga microbiana total(26).

A presença de termodúricos foi registrada em 38,6% das amostras, atingindo contagem máxima de 7,2 x 10e3 UFC/ml. Esse grupo, que surge no colostro como contaminante secundário, é composto por microorganismos que resistem ao tratamento térmico da pasteurização(21).

A ocorrência de psicrotróficos restringiu-se a seis amostras, com contagens inferiores a 4,3 x 10e2 UFC/ml. Almeida(21) refere-se a psicrotróficos no colostro como contaminantes secundários, capazes de crescerem à temperatura de refrigeração independente da sua temperatura ótima de crescimento. Dentre os principais gêneros de psicrotróficos incluem-se: Enterobacter, Achomobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Pseudomonas, Bacillus e Clostridium, sendo que os três últimos são também incluídos no grupo dos proteolíticos(20).

Os termodúricos-psicrotróficos, ausentes em todas as amostras analisadas, são contaminantes secundários com características comuns às descritas para os termodúricos e os psicrotróficos(27). A capacidade de resistir à pasteurização faz com que este grupo exerça um efeito decisivo sobre a conservação do colostro humano ordenhado(21).

A capacidade de crescer, mesmo com o colostro mantido sob refrigeração, faz com que o grupo dos termodúricos-psicrotróficos assuma particular importância na ecologia microbiana do colostro, sob o ponto de vista de sua conservação(21).

A presença de proteolíticos restringiu-se a 15,7% das amostras, com contagem máxima de 1,4 x 10e3 UFC/ml. Já os microorganismos proteolíticos-psicrotróficos, contaminantes secundários que reúnem características comuns às dos proteolíticos e psicrotróficos, foram detectados em 1,43% das amostras. Estes microorganismos poderiam promover proteólise durante o crescimento no colostro, caso este fosse mantido à temperatura de refrigeração(27).

A presença de bactérias lipolíticas foi detectada em três amostras, com contagens que variaram de 1,0 x 10e1 até 4,3 x 10e3 UFC/ml. Estes microorganismos seriam capazes de produzir lipólise oxidativa e hidrolítica no colostro(28).

A ocorrência de bolores e leveduras foi registrada em 11% das amostras, com contagens de 1,3 x 10e1 a 6,0 x 10e3 UFC/ml. A presença destes contaminantes está associada a condições higiênico-sanitárias insatisfatórias das doadoras(21).

Os resultados revelaram a presença de S. aureus em 44,3% das amostras, com 100% das contagens inferiores a 10e3 UFC/ml. A maior preocupação quanto à presença deste microorganismo incide sobre a ocorrência de S. aureus enterotoxigênicos, que produz toxinas resistentes à pasteurização, quando a população atinge contagens da ordem de 10e5 UFC/ml, ou superior(19).

O grupo coliforme foi detectado em 5 amostras, com contagens que variaram entre 0,3 x 10e0 a 1,1 x 10e2 NMP/ml. Após submeter estas amostras ao teste confirmatório para coliformes totais, os resultados permaneceram inalterados. Contudo, não foram encontrados coliformes fecais; de acordo com a literatura(19), sua presença indicaria a possibilidade de ter ocorrido contaminação de origem fecal. A ausência de Streptococcus do grupo D confirma os resultados obtidos para coliformes fecais.

A população de bactérias lácticas se fez presente em 26 das 70 amostras (37%), sendo inferior a 10e4 UFC/ml em todas as contagens realizadas. As bactérias do ácido láctico (BAL), e as substâncias por elas produzidas mostram efeitos benéficos na área gastrintestinal. Elas previnem aderência, estabelecimento e replicação de vários patógenos na mucosa entérica por vários mecanismos. Além disso, lançam diversas enzimas no lúmen intestinal e mostram sinergismo na digestão(29).

Nos últimos anos, estudos sobre probióticos se expandiram significativamente, com o surgimento de várias cepas de microorganismos, cada uma apresentando uma variedade de benefícios. As listas de características funcionais e de benefícios são comuns a diversos probióticos(30), porém as bactérias produtoras de ácido láctico são os probióticos melhor estudados, particularmente Lactobacillus sp. e as Bifidobacterium sp(2).

Segundo De Roos & Katan (15), os probióticos mais citados em estudos recentes são Lactobacillus GG (22 estudos), Lactobacillus acidophilus (16 estudos), Bifidobacterium bifidum (6 estudos) e Enterococcus faecium (7 estudos).

Estudos clínicos mostram que probióticos específicos, como as bactérias produtoras de ácido lático, podem aliviar ou prevenir desordens e reduzir riscos de doenças intestinais(31). O consumo de produtos fermentados com BAL pode apresentar efeitos antitumorais. Esses efeitos são atribuídos à inibição de atividade mutagênica provocada pela diminuição de várias enzimas implicadas na geração de substâncias carcinogênicas e/ou mutagênicas(29).

Em um estudo quali-quantitativo, envolvendo 26 marcas de iogurtes, as cepas de Lactobacillus isoladas, consideradas como probióticos, estavam presentes em no mínimo 10e5 UFC/g dos produtos antes de terminar o período de validade dos mesmos(32).

O uso de agentes probióticos, particularmente bifidobactérias, pode ter efeito contra diarréias agudas. Em populações pediátricas, o efeito de agentes probióticos parece ser muito significante contra diarréias virais (rotavírus), sugerindo que um mecanismo imunológico seja responsável pelos efeitos benéficos(33). Já foi também verificado que a administração oral de Lactobacillus casei Shirota (LcS) aumenta a imunidade inata, estimulando a atividade de células Natural Killer(5).

O Lactobacillus casei Shirota é uma das bactérias probióticas mais usadas na produção de leite fermentado e de bebidas lácteas ácidas. A recuperação de tais bactérias a partir das fezes foi da ordem de 10e7 bactérias por grama, indicando que o LcS sobrevive e se multiplica no trato gastrintestinal após a ingestão do leite fermentado(34).

Segundo Penna e col.(3), os microorganismos somente influem no ecossistema onde eles se encontram quando suas populações são superiores a 10e7 UFC/g ou ml do conteúdo, porém no caso específico da flora intestinal de crianças recém-nascidas, tais valores podem ser menores. Entretanto, até o momento, não foram encontrados na literatura os valores limítrofes.

O padrão de colonização bacteriana no intestino de crianças prematuras é diferente do observado em crianças a termo. Pelo fato de as primeiras requererem cuidados higiênicos intensivos, adquirem microorganismos intestinais mais lentamente, e o estabelecimento de flora bífida também é retardado(8). A colonização bacteriana lenta do intestino, com um número limitado de espécies, tende a ser perigosa, pelo fato de o super crescimento bacteriano ser um dos fatores que promovem a translocação bacteriana(8). Logo, alimentar crianças com o colostro de suas mães pode apresentar benefícios, inclusive neste aspecto.

A princípio, as amostras obtidas das mães de prematuros que estavam em uso de antibióticos não apresentaram resultados diferentes das demais; no entanto, como não foram estabelecidos controles para se verificar a influência destes parâmetros sobre a flora pesquisada, não será possível analisar estes aspectos.

A avaliação conjunta dos resultados do presente estudo revela a ausência de microorganismos patogênicos e a ocorrência de contaminantes secundários em níveis incapazes de comprometer a qualidade microbiológica do colostro. No entanto, demonstram a ocorrência de uma microbiota significativa, em especial de bactérias produtoras de ácido lático, que provavelmente funcionam como probióticos, sendo disponibilizados aos seus receptores.